آنالیز عددی
به علت اینکه شناسایـی تاکسون های Viola در سطح زیربخشه به راحتی امکان پذیر است، برای تعییـن حدود تاکسون ها در سطح گونه ای، مطالعات آنالیز عددی انجام شد. نمونه های مورد مطالعه، به صورت جداگانه در 3 ماتریکس شامل زیربخشه Viola و زیربخشه Rostratae در دوفاز، مورد بررسی و آنالیز قرار گرفت.
3-4-1 زیربخشه Viola
ماتریکس زیربخشه Viola، از 80 نمونه از 3 گونه V. alba ssp. alba، V. sintenisii و V. odorata تشکیل شده است؛ تست تشخیص78 برای این 3 گونه به صورت دو به دو انجام شده و صفاتی که برای هر 3 گروه از سطح معنی داری پایینی (بیشتر از 05/0) برخوردار بودند از ماتریکس حذف شدند. این صفات عبارتند از: طول مهمیز، عرض کاسبرگ و زایده کاسبرگ. درخت حاصل از صفات داده شده به روش Euclidian / UPGMA در شکل 3-4-1-1 نشان داده شده است:

همانطور که در شکل های 3-4-1-1 و 3-4-1-2 مشاهده می شود، نمونه های مورد مطالعه، در 3 کلاد عمده قرار گرفته اند. V. sintenisii کلاد خواهری با دو گونه دیگر تشکیل داده است. دو گونه V. alba و V. sintenisii به خوبی از یکدیگر متمایز شده اند. همچنین، تعدادی از نمونه های V. sintenisii، به دلیل اندازه بزرگ و غیر معمول در قاعده درخت پلی تومی تشکیل داده اند، که این نمونه ها، از نظر شکل ظاهری قابل شناسایی هستند. در آنالیز PCA، تاکسون های مربوط به سه گونه این بخشه، در 3 گروه تقسیم بندی شده است. اگر چه تعدادی از تاکسون های دو گونه نزدیک به هم، V. alba ssp. alba و V. sintenisii تقریباً در یک محل قرار گرفته اند. از آنجا که در همه موارد، پلات سه بعدی تمایز بیشتری نشان نداد، در نتایج از آن استفاده نشد.

3-4-2 زیربخشه Rostratae
3 گونه این زیر بخشه، شامل V. caspia، V. reichenbachiana و V. rupestris، در دو ماتریکس جداگانه که از 69 نمونه در مرحله گل دهی و 40 نمونه در مرحله میوه دهی تشکیل شده اند، بررسی شد. تست تشخیص دو به دو گونه ها نشان داد که تمامی صفات از سطح معنی داری خوبی برخوردار هستند (کمتر از 05/0)؛ پس همه صفات وارد آنالیز شدند. درخت های ترسیم شده برای نمونه های مرحله گل دهی و میوه دهی و پلات های دو بعدی حاصل از آنالیز PCA، در شکل های 3-4-2-1 تا 3-4-2-4 نشان داده شده است.

همانطور که در شکل 3-5-2-1 مشاهده می شود، V. rupestris به خوبی از دو گونه دیگر متمایز شده، و V. caspia نیز کلاد بزرگی تشکیل داده است که در آن انعطاف پذیری صفات79 در این گونه کاملاً مشخص است. به طوریکه نمونه ها به صورت نامشخص در این کلاد قرار گرفته اند. قابل ذکر است که دو نمونه هیبرید، در قاعده درخت قرار گرفته اند. در پلات حاصل از آنالیز PCA، تاکسون های مربوط به V. rupestris از V. caspia جدا شده و یک گروه مجزا تشکیل داده است.

3-5 مطالعات ملکولی
3-5-1 تکثیر قطعه nrDNA ITS و cpDNA trnL-F نمونه ها:
پس از استخراج DNAژنومی، جهت تکثیر توالی ITS در 14 نمونه و trnL-F در 9 نمونه از 6 گونه متعلق به بخشه های Viola و Rostratae موجود در ایران، تحت شرایط ذکر شده در فصل 2، PCR با گرادیانت دمایی80، صورت گرفت. برای اطمینان از صحت انجام مراحل تکثیر، نمونه های بدست آمده پس از انجام مراحل PCR بر روی ژل آگارز %1 برده شدند. سپس باند های DNA زیر نور ماوراء بنفش و به کمک دستگاه Gel documented مشاهده شدند(شکل 3-5-1-1).
در مرحله ی بعد به منظور تعیین توالی قطعات تکثیر یافته از nrDNA و cpDNA نمونه ها، با استفاده از کیت استخراج DNA از PCR81 و کیت تخلیص DNA از GEL82 نمونه ها خالص سازی شده و جهت اطمینان از خلوص DNA بر روی ژل آگارز %1 برده شد. تصاویر ژل حاصل از آشکارسازی باند های DNA در شکل 3-5-1-2 و 3-5-1-3 قابل مشاهده اند.

دسته بندی : پایان نامه ها

دیدگاهتان را بنویسید