دانلود پایان نامه

شیطان کوه، 13655-GUH، بهمن 87، یوسفی
V. alba ssp. alba 2
گیلان: ماسوله، 13657-GUH، اسفند 87، یوسفی و سعیدی
V. odorata
گیلان: لاهیجان، شیطان کوه، 13658-GUH، بهمن 87، یوسفی
V. sintenisii

2-3-1 استخراج DNA ژنومی از گیاه با استفاده از روش CTAB56
به منظور استخراج DNA، از روش CTAB (Doyle & Doyle, 1987) با کمی تغییرات استفاده شد. از این روش هم جهت استخراج DNA از نمونه های تازه و هم جهت استخراج DNA از نمونه های هرباریومی می توان استفاده نمود. مراحل استخراج به شرح زیر می باشد:
1. حدود mg 70- 50 از بافت برگ برداشته و در هاونی تمیز و اتوکلاو شده قرار گرفت.
2. مقداری نیتروژن مایع به داخل هاون محتوای برگ ریخته و به خوبی ساییده شده تا بافت برگ کاملاً پودر شود.
3. مقداری از بافر CTAB در حدود lµ1800 درون هاون ریخته ( جهت بالا بردن ضریب اطمینان از هر نمونه 3 استخراج صورت گرفت) و محلول یکنواخت سبز رنگی تشکیل شد.
4. سه میکروتیوب ml 1.5 استریل برداشته و در هر میکروتیوب lµ600 از هموژن داخل هاون ریخته شد.
5. در این مرحله در زیر هود شیمیایی، lµ20 مرکاپتواتانول به هر نمونه اضافه شد.
6. هر میکروتیوب به آرامی تکان داده شده و در بن ماری˚C 60- 50 به مدت 30 دقیقه قرار گرفت. در این مرحله به منظور یکنواخت شدن محلول، هر 10- 5 دقیقه هر میکروتیوب به آرامی تکان داده شد.
7. بعد از گذشت نیم ساعت نمونه از بن ماری خارج شده و lµ800 از محلول کلروفرم – ایزوآمیل الکل (با نسبت 24:1 حجمی- حجمی) به هر میکروتیوب اضافه شد.
8. میکروتیوب ها به مدت 20 دقیقه روی دستگاه Shaker گذاشته شد.
9. سپس میکروتیوب ها به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 سانتریفوژ شدند.
10. در این مرحله 3 فاز تشکیل شد; فاز بالایی DNA، فاز میانی قند و پروﺗﺌین و در فاز انتهایی کلروفرم خواهد بود. مایع رویی آنها به کمک سمپلرکشیده و درون میکروتیوب های ml 1.5 جدید ریخته شد.
11. مجدداً lµ800 از محلول کلروفرم ـ ایزوآمیل الکل با نسبت 24:1 به هر میکروتیوب اضافه شد.
12. میکروتیوب ها به مدت 20 دقیقه روی دستگاه Shaker گذاشته شد.
13. مجدداً میکروتیوب ها به مدت 15 دقیقه با دور rpm 12000 سانتریفوژ شدند.
14. در این مرحله نیز 3 فاز تشکیل شد، مایع رویی به کمک سمپلر کشیده و درون میکروتیوب های جدید ریخته شد.
15. lµ 700 ایزوپروپانول (باید حتما قبل از این مرحله ایزوپروپانول در درون فریزر ˚C20- سرد شده باشد) به هر میکروتیوب اضافه شد. تنها یک بار به آرامی میکروتیوب تکان داده شد و در این مرحله در صورت وجود DNA، هاله ی سفید رنگی از آن مشاهده خواهد شد.
16. میکروتیوب ها جهت آماده سازی برای ادامه ی استخراج به مدت یک روز در فریزر˚C 20- قرار داده شده و یا جهت صرفه جویی در زمان به مدت یک ساعت در فریزر ˚C70- گذاشته شد.
17. بعد از آماده سازی نمونه میکروتیوب ها به مدت 15 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفوژ شدند.
18. مایع رویی به آرامی دور ریخته شده و به هر میکروتیوب lµ1000 اتانول %70 اضافه شد (اتانول %70 حتماً باید در درون فریز C˚20- سرد شده باشد).
19. مجدداً میکروتیوب ها به مدت 15 دقیقه با دور rpm 10000 سانتریفوژ شدند.
20. مایع رویی کاملاً دور ریخته شده به طوری که تنها رسوب DNA درون میکروتیوب ها باقی ماند.
21. جهت از بین رفتن بوی الکل، میکروتیوب ها با در باز در داخل آون با دمای C˚42 گذاشته شدند.
22. بعد از پریدن الکل، با افزودن lµ50 آب استریل به هر میکروتیوب، رسوب DNA در آب کاملاً حل شد.
23. نمونه ها تا زمان استفاده از آنها در فریزر C˚20- نگهداری خواهد شد.

2-3-1-1 روش تهیه بافر CTAB
مواد و محلول های مورد نیاز برای بافر CTAB عبارتند از:
1) CTAB (2%)
2) NaCl 1.4 M
3) EDTA 0.5 M, pH= 8.0, 20mM
4) TRIS 1 M, pH=8.0, 100mM
5) dd H2O
جهت تهیه بافر CTAB، ml4 از EDTA M 5/0و ml 10 از TRIS M 1 برداشته و داخل یک ارلن ریخته شد. g 2 پودر CTAB به همراه lµ 8/1 از M 5 محلولNaCl به محتویات داخل ارلن اضافه شده و حجم محلول با آب مقطر به ml 100 رسانده و برای رسیدن به یک محلول شفاف و یکدست از همزن مغناطیسی استفاده شد (غلظت ترکیبات مورد استفاده در حجم نهایی عبارتند از: CTAB 1% ، 1/4 M NaCl، 20 mM EDTA و 100 mM Tris با PH= 8).
2- 3 – 1 -2 تعیین غلظت و خلوص DNA:
برای بررسی کیفیت وکمیت DNA ژنومی استخراج شده از گیاه، جذب محلول رقیق شده (با رقت 100) در طول موج های nm 280-260 انداره گیری شد و جهت تعیین غلظت و خلوص DNA استخراج شده از رابطه Conc. DNA (µg/µl) = 50 × D × A260 استفاده می شود که D ضریب رقت ( در اینجا 100) می باشد. جذب 0/1 در 260 نانومتر نمایانگر وجود gµ50 از DNA در هر میلی لیتر محلول است. در حدود lµ 7 از نمونه برداشته شده و در داخل میکرو تیوب ریخته شد. lµ 693 آب به آن اضافه شده تا حجم نمونه به lµ 700 برسد. سر انجام با تعیین نسبتg/ml) µA260/A280 ( کیفیت DNA استخراج شده مورد ارزیابی قرار گرفت (حداکثر جذب DNA در 260 نانومتر و پروﺗﺌﻴﻦ در 280 نانومتر است). مناسب ترین نسبت جذبی بین 9/1- 7/1 است.

2- 4 تکثیر قطعات DNA مورد نظر
2- 4- 1 آغازگر ها57:
واکنش زنجیره ای پلیمراز58 به منظور تکثیر ناحیه ژنی ITS، با آغازگرهای ITS5 (F) و ITS4 (R) معرفی شده توسط White (1990) و همکاران صورت گرفت و توالی کلروپلاستی trnL-F با استفاده از آغازگر های trnL-F f و trnL-F c معرفی شده توسط Taberlet (1991) و همکارانش انجام شد. جدول شماره 2-4- 1- 1 توالی آغازگر های مورد استفاده برای PCR را نشان می دهد.
جدول شماره 2- 4- 1- 1 توالی آغازگر های مورد استفاده جهت تکثیر قطعات مورد نظر در این تحقیق
توالی آغازگر نام آغازگر
nrDNA IT
S
ITS5 (F) 5′ -GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG- 3′
ITS4 (R) 5′ -TCCTCCGCTTATTGATATGC- 3′
CpDNA trnL-F
trnL-F f 5′ -CGAAATCGGTAGACGCTACG – 3′
trnL-F c 5′ -ATTTGAACTGGTGACCGAG – 3′

2- 4- 2 دستورالعمل واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR):

ترکیب مورد استفاده به منظور تکثیر قطعه DNA مورد نظر به شرح زیر بود:

DNA 1 μl
Forward Primer 1 μl (concentration=10 pmol)
Reverse Primer 1 μl (concentration=10 pmol)
PCR PreMix 2 μl
Distilled Water 15 μl
————————————-
Total volume 20 μl

2-4-3 برنامه واکنش PCR برای تکثیر قطعات DNA مورد مطالعه:
برای تقویت ناحیه ژنی مورد نظر از دستگاه Thermocycler، مدل GeneAmp 9700 از کمپانی Applied Biosystems (آمریکا) استفاده گردید. زمان انجام مراحل PCR بدین ترتیب می باشد:

1. واسرشته سازی اولیه59 5:00 دقیقه °C 93
2. واسرشته سازی 00:45 ثانیه °C 93
3. اتصال60 00:45 ثانیه °C 56 -48
4. بسط61 1:30 دقیقه °C 72
5. بسط نهایی 5:00 دقیقه °C 72
لازم به ذکر است که جهت بدست آوردن دمای Annealing، PCR با گرادیانت دمایی62 انجام شد. برای اطمینان از صحت انجام مراحل تکثیر، نمونه های بدست آمده پس از انجام PCR بر روی ژل آگارز %1 برده شده و به مدت 30 دقیقه الکتروفورز شدند.

2-4-4 الکتروفورز ژل آگارز:
جهت اطمینان از تکثیر DNAو سنجش کیفیت آن، محصول PCR بر روی ژل آگارز %1 برده شده و الکتروفورز انجام شد. برای تهیه ژل %1، مقدار ml 30 بافرTBE (1x) به g 3/0 پودر آگارز اضافه نموده، روی هیتر قرار داده، تا زمانی که این محلول جوش آمده و شفاف شود. از همزن مغناطیسی جهت یکنواخت کردن محلول استفاده شد. پس از سرد شدن محلول آگارز و قبل از بسته شدن ژل، lµ30 محلول اتیدیوم بروماید به غلظت mg/ml 10، به آن اضافه شده و پس از هم زدن محلول در داخل سینی ژلی که شانه ی مخصوص تشکیل چاهک ها از قبل در داخل آن قرار داده شده بود، ریخته شد. پس از سرد شدن و بسته شدن کامل ژل به مدت 20 دقیقه، شانه از آن بیرون کشیده شده و سینی به داخل مخزن مخصوص الکتروفورز که حاوی محلول TBE (1X) است، منتقل شد. µl 5 از نمونه با µl 1 Loading buffer (dye) مخلوط و در چاهک ها ریخته شد.
برای تخمین اندازه و غلظت DNA تکثیر یافته حدود lµ 1، DNA Ladder در یکی از چاهک ها ریخته و با روشن نمودن دستگاه و تنظیم ولتاژ حدود V 120-110، الکتروفورز به مدت 45 دقیقه انجام شد. پس از اتمام کار دستگاه، با استفاده از نور ماوراء بنفش و به کمک دستگاه Gel documented باند های DNA بر روی ژل آشکار و قابل مشاهده خواهد بود.

بافر (X10) TBE
مواد مورد نیاز
تریس بازی g 8/10
بوریک اسید g 5/5
EDTA g 92/0
مقادیر ذکر شده را با هم مخلوط کرده و با آب مقطر به حجم ml 100 می رسانیم. برای حل شدن بهتر می توان از همزن مغناطیسی استفاده کرد. برای تهیه بافر (X1) TBE، یک حجم از بافر را با آب مقطر 10 برابر رقیق می کنیم.

2-4-5 تخلیص PCR
2-4-5-1 تخلیص محصول PCR
پروتوکل استخراج DNA از محصول PCR با استفاده از کیت PCR purification از شرکت بیونیر63به شرح زیر می باشد:
1. اضافه نمودن 5 برابر بافر شماره 1 (PCR Binding Buffer) به محصول PCR؛ به عنوان مثال اگر محصول PCR، lµ 10 باشد، lµ 50 از بافر شماره 1 اضافه می شود. سپس توسط ورتکس نمونه کاملاً مخلوط شد.
2. این مخلوط به تیوب ستونی DNA binding انتقال داده شده و به مدت 1 دقیقه و با دور rpm 13000 سانتریفوژ شد.
3. بعد از سانتریفیوژ مایع زیرین دور ریخته شد.
4. lµ 500 بافر شماره 2 به ستون اضافه شده و به مدت 1 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ شد (در این مرحله نمک ها و ناخالصی های قابل حل در ستون، خارج می شوند).
5. مایع زیرین دور ریخته شده و مجدداً lµ 500 بافر شماره 2 به ستون اضافه و به مدت 1 دقیقه و با دور rpm 13000 سانتریفوژ شد.
6. مایع زیرین دور ریخته و جهت خشک نمودن تیوب به مدت 2 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ شده تا باقی مانده اتانول ته نشین شود.
7. فیلتر حاوی DNA به یک میکروتیوب ml 1.5 جدید منتقل شد.
8. سپس lµ 30 بافر شماره 3 افزوده شده (حتماً باید در مرکز فیلتر ریخته شود) و به مدت 1 دقیقه صبر کرده تا کاملاً شستشو شود.
9. سپس میکروتیوب به مدت 5 دقیقه در بن ماری °C70 قرار داده شد.
10. قطعات DNA شستشو شده به مدت 1 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریفوژ شدند.
11. میکروتیوب حاوی DNA آماده و جهت شستشوی بیشتر، فیلتر به میکروتیوب جدید انتقال داده شد. سپس lµ 15 بافر شماره 3 به آن اضافه و مراحل 9 و 10 تکرار شده که به دنبال آن مابقی DNA که رقیق تر است، شسته شده و از ستون خارج شد.

2-4-5-2 تخلیص محصول PCR از ژل
مراحل استخراج DNA از ژل با استفاده از کیت Gel PCR putificationاز شرکت بیونیر64 بشرح زیر می باشد:
1. ابتدا محصول PCR روی ژل برده شد و برای مشاهده باندها، تکه ژل مورد نظر در دستگاه Geldoc مشاهده و قطعه مورد نظر را در حالتی که کمترین مقدار ژل اضافی به آن چسبیده باشد برش خورد.
2. تکه های ژل برش خورده حاوی DNA مورد نظر، در میکروتیوب های استریل که از قبل وزن آن مشخص شده بود،


پاسخی بگذارید