دانلود پایان نامه

مورد نیاز
محلول های مورد استفاده در الکتروفورز
محلول
مواد تشکیل دهنده
استوک آکریل آمید
شامل 30% آکریل آمید و0/8% بیس آکریل آمید.
بافر ژل پایین با 8/8 pH:
18/2 گرم تریس بازی (0/5 مولار) و 0/4 گرم SDS را در 70 میلی لیتر آب مقطر حل کرده وpH را با استفاده از HCL 2 مولار در 8/8 تنظیم می کنیم و اوره با غلظت نهایی 4 مولار افزوده و حجم نهایی را با آب مقطر به 100 میلی لیتر می رسانیم.
بافر نمونه
0/1 مولار تریس اسیدی حاوی 2%SDS (W/V) ، سوکروز 20% (W/V) ، 2-مرکاپتواتانول 1% ، 0/001 (W/V) برموفنل بلو و اوره با غلظت نهایی 8 مولار (این بافر X2 است.)

3-16-4- تهیه ژل پایین SDS-PAGE
ماده
مقدار
بافر ژل پایین با 8/8 pH: حاوی اوره 4 مولار
5 میلی لیتر
محلول آکریل آمید ٣٠ درصد بعلاوه بیس آکریل آمید8/0 درصد
10 میلی لیتر
آب مقطر
5 میلی لیتر
آمونیوم پر سولفات 10 %
100 میکرولیتر
TEMED 10%
100 میکرولیتر

قبل از اضافه نمودن تمد، محلولها را خوب مخلوط نموده و سپس به مدت ۵ دقیقه با پمپ خلاء عمل گازگیری ٢ را انجام می دهیم تمد را در هنگام استفاده از محلول، اضافه می نماییم. از ژل ١٠ درصد برای جدا کردن پروتئین های با وزن مولکولی ٢۵ تا ١٠٠ کیلودالتون استفاده می شود
3-16-5- تهیه ژل بالا با SDS-PAGE
ماده
مقدار
بافر ژل بالا با 8/6 pH: حاوی اوره 4 مولار
5/2میلی لیتر
محلول آکریل آمید ٣٠ درصد بعلاوه بیس آکریل آمید 8/0 درصد
3/1 میلی لیتر
آب مقطر
1/6 میلی لیتر
آمونیوم پر سولفات 10 %
50 میکرولیتر
TEMED 10%
100 میکرولیتر

تهیه این ژل نیز مثل ژل تحتانی بوده و تا قبل از اضافه نمودن تمد به خوبی مخلوط و گازگیری
می گردد. همچنین تمد در هنگام مصرف ژل اضافه م یشود.
نمونه های کونژوگه و اگزوتوکسین در چاهک ها ریخته شد و الکتروفورز در 60 میلی ولت برای 5/3 ساعت ( تا 30 دقیقه بعد از خروج برمو فنل بلو از انتهای ژل) ادامه یافت. پس از اتمام الکتروفورز ژل جدا و رنگ آمیزی گردید.
3-16-6-رنگ آمیزی ژل پلی آکریل آمید
پس از انجام الکتروفورز به منظور دیدن باندهای پروتئینی، ژل را رنگ آمیزی نمودیم . برای رنگ آمیزی ژل از روش رنگ آمیزی کوما سی بلو استفاده گردید . در این روش ثبات رنگ طولانی مدت بوده و نگهداری ژل رنگ شده آسانتر است.
3-16-7- محلولهای مورد نیاز
١- محلول رنگ
2/0 گرم کوماسی بلوR250 (سیگما) در 40 میلی لیتر متانول (مرک) حل گردید؛ سپس 10 میلی لیتر اسیداستیک گلایسیال(مرک) و 50 میلی لیتر آب مقطر افزوده شد . پس از مخلوط کردن در ظرف شیشه ای در ۴ درجه سانتی گراد نگهداری می گردد.
٢ – محلول رنگ بر
به ۴٠٠ میلی لیتر متانول، ١٠٠ میلی لیتر اسید استیک گلایسیال و ۵٠٠ میلی لیتر آب مقطر اضافه گردید. پس از مخلوط کردن در شیشه در دار نگه داری می شود.
٣- محلول نگهداری ژل
70 میلی لیترمیلی لیتر اسید استیک گلایسیال با ١٠ میلی لیتر متانول مخلوط گردید و سپس حجم آن با آب مقطر به ١٠٠ میلی لیتر رسید.
3-16-8- روش رنگ آمیزی
١- ژل در داخل ظرف رنگ قرار گرفت؛ سپس مقداری رنگ به آن اضافه گردید و مدت ١٠ تا ١۵ دقیقه روی شیکر قرار داده شد.
٢- رنگ را خارج نموده و سپس با آب مقطر ژل را شستشو دادیم.
٣- ژل در داخل محلول رنگ بر، روی شیکر قرار گرفت و با شفاف شدن زمینه ژل باندهای
پروتئینی نمایان شدند.
۴- در مرحله آخر ژل در محلول نگهدارنده قرار داده شد.
3-17- آزمون بررسی فعالیت باکتریسیدالی سرم حیوان ایمیون (SBA104)
3-17-1- اصول آزمون SBA
واکسن های موفق بر علیه پاتوژنهای خارج سلولی سبب القاء زیر کلاس های متعدد IgG در مقابل اپی توپهای سطحی و قابل دسترس باکتری می شوند. اما در مورد باکتریهای داخل سلولی همه زیر کلاس های IgG خاصیت حفاظتی در برابر عفونت ناشی از این باکتریها را نداشته و توانایی کشندگی وابسته به کمپلمان را ندارند. به همین دلیل تست ارزیابی فعالیت باکتریسیدالی سرم در این گروه از اهمیت زیادی برخوردار است. مکانیسم تست بر مبنای اثرات کشندگی آنتی بادی القایی در خلال سیر طبیعی عفونت یا بعد از انجام واکسیناسیون پایه ریزی شده است. این آزمون به بررسی خاصیت کشندگی آنتی بادیهای ایجاد شده با واسطه فاکتورهای کمپلمان در شرایط خارج بدن 1 می پردازد.آنتی بادیهای باکتریسیدالی با فعال کردن مسیر آبشاری کمپلمان، سبب ایجاد کمپلکس تهاجم غشایی شده و در نهایت باعث لیز باکتری می شوند.
3-17-2- مواد مورد نیاز برای آزمون SBA Serum Bactericidal Assay)) :
1- با استفاده از لوله مک فارلند از کشت 18 ساعته همو فیلوس آنفولانزای تیپ b سوسپانسیون باکتریایی حاوی CFU/ml103تهیه می گردد.
2- سرم حیوان ایمن شده
سرم های به دست آمده از مراحل مختلف تزریق را در C°56 به مدت نیم ساعت در بن ماری غیر فعال می نماییم.
3- منبع کمپلمان خارجی
برای منبع کمپلمان خارجی در آزمون از سرم خون نوزاد خرگوش 3 هفته ای استفاده می نماییم. به همین دلیل در شرایط کاملا استریل از قلب نوزاد خرگوش خون گیری انجام شد و سرم خون حیوان بعد از جدا سازی در C°20- تا زمان انجام آزمون نگهداری گردید.
4- میکروپلیت
در این آزمون از میکروپلیت های استریل 96 خانه ای با انتهای U شکل استفاده گردید.
3-17-3-روش انجام آزمون
ابتدا از سویه هموفیلوس آنفولانزای تیپ b در یک لوله کشت داده و 24 ساعت در دمای ٣٧ درجه سانتیگراد انکوبه می کنیم. پس از این مدت، لوله را با سرم فیزیولوژی شستشو داده و مایع غلیظ را به رقت لوله ٣ مک فارلند می رسانیم. محلول
DPBS، سرم بچه خرگوش غیر فعال شده ، 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی حاوی CFU/ml103 و در چاهک اول از میکروپلیت ٩۶ خانه λ ١٠٠ سرم غلیظ تزریق نوبت اول را ریخته و آن را در خانه های بعدی از رقت 1/2 تا رقت 1/128 می رسانیم. در ردیف بعدی و در خانه اول سرم غلیظ نوبت دوم را ریخته و در خانه های بعدی تا رقت 1/128 می رسانیم.کنترل های زیر را نیز در نظر می گیریم :
1- کنترل مثبت : 50 لاندا سرم غیرفعال منفی (روز صفر)، 50 لاندا بافر DPBS+ 50 لاندا سوسپانسیون باکتری + 50 لاندا سرم بچه خرگوش
2- کنترل باکتریایی : 100 لاندا تامپون DPBS +50 لاندا سرم بچه خرگوش + 50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی Cfu/ml103
3- کنترل سلولی: 50 میکرولیتر منبع کمپلمان خارجی غیر فعال + 50 میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی Cfu/ml103، 50 میکرولیتر تامپون DPBS
4- کنترل کمپلمان فعال : 50 لاندا سرم نوزاد خرگوش (فعال) + 100 لاندا تامپون DPBS+ 50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی
5- کنترل کمپلمان غیرفعال:
50 لاندا سرم نوزاد خرگوش غیرفعال +100 لاندا تامپون DPBS +50 لاندا سوسپانسیون باکتریائی

1

سرم رقیق شده

+

+

+

+

+

+

+

+
سوسپانسیون باکتریایی (50 میکرو لیتر)
+
+
+
+
+
+
+
+
منبع کمپلمان خارجی(سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)
روش انجام سرم باکتریسیدال اسی در میکروپلیت

کنترل تهیه شده در آزمون SBA
کنترل
باکتری

کنترل
کمپلمان

کنترل
سلولی

کنترل
مثبت

کنترل
منفی

کنترل مواد

_

_

_

_

+
سرم حیوان قبل از تزریقات (سرم منفی) (50 میکرولیتر)
_
_
_
+
_
سرم کنترل مثبت (50 میکرولیتر)
_
+
+
_
_
D-PBS (50 میکرولیتر)
+
+
+
+
+
سوسپانسیون باکتریایی CFU/ml104
(50 میکرولیتر)
_
_
+
+
+
منبع کمپلمان خارجی غیر فعال (سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)
_
+
_
_
_

منبع کمپلمان خارجی(سرم نوزاد خرگوش) (50 میکرولیتر)

فصل چهارم


پاسخی بگذارید