جدول ۱-۳: نتایج مورد انتظار حاصل از آزمایشات نام برده
الف – آزمون کواگولاز
به روش اسلاید انجام گرفت:
یک قطره از پلاسمای خرگوش که با بهره گرفتن ازEDTA تهیه شده روی یک لام خشک و تمیز قرار داده می­شد. یک قطره آب مقطر یا سرم فیزیولوژی در نقطه مجزائی به عنوان کنترل قرار داده می­شد. بااستفاده از لوپ استریل مقداری از کلنی باکتری در هر یک از قطرات فوق به صورت سوسپانسیون مخلوط می­شد. سپس از نظر تجمع باکتری­ ها بررسی می­شدند.
ب -آزمون کاتالاز
یک قطره از محلول ۳% پراکسید هیدروژن را بر روی لام قرار داده و مقداری از باکتری در آن حل می­شد. پیدایش حباب (در اثر آزاد شدن اکسیژن) بیانگر مثبت بودن آزمایش می باشد.
ج -آزمون اکسیداز
روی یک لام یک قطعه کاغذ صافی گذاشته، سپس محلول ۱ درصد Tetramethyl­-­Phenylenediaminedihydrochloride روی آن ریخته و با بهره گرفتن از پیپت پاستور یک کلنی از باکتری برداشته می­شد و روی کاغذ صافی پخش می­شد. بعد از ۱۵ ثانیه نتیجه تست قرائت می­شد. در صورتی که این آنزیم در میکروارگانیزم وجود داشته باشد تحت تاثیر این آنزیم معرف به رنگ بنفش (آبی) ظاهر می شود.
۳-۲-۳- آماده سازی محیط­های کشت
جهت آماده سازی محیط های کشت طبق دستور العمل­های شرکت سازنده [(مرک آلمان و Antec Diagnostic (ATD)] به میزان مورد نیاز از پودر مورد نظر در مقدار مناسب آب مقطر حل می­شد. محیط TSB به لوله­های آزمایش انتقال می­یافت. سپس محیط­های ساخته شده (بلاد آگار، مانیتول سالت آگار، مالتوز براث، DNase آگار، اسکولین بایل سالت آگار و TSB) در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد به مدت ۱۵ دقیقه استریل می­شدند. پس از استریل شدن و سرد شدن محیط های آگار تا دمای ۴۰ تا ۵۰ درجه سانتی گراد در دمای اتاق، این محیط­ها در زیر هود به پلیت­های استریل منتقل می­شدند.
الف- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط DNase آگار
یک کلنی از باکتریاستافیلوکوکوس آرئوس به صورت یک خط مستقیم روی محیط DNase آگار با لوپ کشت داده می­شد ونتیجه بعد از ۲۴ ساعت گرم خانه­گذاری در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرائت می­گردید.
ب- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مانیتول سالت آگار
یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مانیتول سالت آگار با لوپ کشت داده می­شد و نتیجه بعد از ۲۴ ساعت گرم خانه­گذاری در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرائت می­گردید.
ج – کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط اسکولین بایل سالت آگار
این محیط به صورت شیبدار است. یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس به صورت یک خط مستقیم روی محیط اسکولین بایل سالت آگار با لوپ کشت داده می­شد و نتیجه بعد از ۲۴ ساعت گرم خانه­گذاری در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرائت می­گردید.
د- کشت استافیلوکوکوس آرئوس روی محیط مالتوز براث
یک کلنی از باکتری استافیلوکوکوس آرئوس با لوپ در محیط مالتوز براث کشت داده می­شد و نتیجه بعد از ۲۴ ساعت گرم خانه­گذاری در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد قرائت می­گردید.
پس از تایید جدایه­ها، آزمایشات زیر بر روی استافیلوکوکوس آرئوس های جدا شده از منابع نام برده شده صورت می­گرفت:

 

 

    • تعیین حساسیت باکتری­ ها نسبت به آنتی­بیوتیک­ها (آنتی­بیوگرام)

 

    • استخراج DNA

 

  • واکنش زنجیره­ای پلیمراز

 

۴-۲-۳- آنتی­بیوگرام
بدلیل به وجود آمدن مقاومت آنتی­بیوتیکی باید عملکرد آنتی­بیوتیک­ها روی باکتری­ ها بررسی شود. ابتدا از کلنی باکتری­ های مورد نظر توسط لوپ در داخل لوله­­های حاوی محیط TSB کشت داده می­شد. لوله­هایی به نام مک فارلند[۸۰] استاندارد وجود دارد که هر کدام دارای کدورت خاصی و از شماره­ ۵/۰ تا ۱۰ است. در اینجا از کدورت ۵/۰ استفاده می­شد که درجه­ کدورت این لوله ۵/۰ مک فارلند باید با درجه­ کدورت لوله­یحاوی TSB که باکتری مورد نظر در آن رشد یافته یکسان باشد.
الف- کشت باکتری ها روی محیط مولر هینتون آگار و قرار دادن دیسک­های آنتی­بیوتیکی روی محیط:
این محیط برای رشد باکتری­ های گرم مثبت و منفی مناسب است­. محیط مغذی است. سوسپانسیون در کنار شعله به کمک سواب استریل آغشته به سوسپانسیون در محیط کشت مولر هینتون آگار به شکل سفره­ای به طوری که کاملا سطح محیط آغشته شود پخش می­شد و برای چند دقیقه در دمای اتاق قرار می­گرفت تا سطح محیط خشک شود. آنتی­بیوتیک­ها به شکل دیسک­های کاغذی که مشخصات­شان روی دیسک تعبیه شده است، می باشد. مشخصات شاملنام اختصاصی آنتی­بیوتیک و شماره­ای که نشان دهنده مقدار آنتی­بیوتیک است، می­باشد. آنتی­بیوتیک­ها با کمک پنس استریل با فواصل معین روی محیط قرار داده می­شد. بعد از ۲۴ ساعت گرم خانه­گذاری در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد نتایج قرائت می­گردید به این صورت که با کمک خط کش از قسمت پشت پلیت قطر هاله­ها اندازه ­گیری می­شد جداول استاندارد وجود دارد که برای هر باکتری و هر آنتی­بیوتیک قطرها در عدم رشد معلوم است. و سپس نتایج با جداول مطابقت داده شدند.
۵-۲-۳- استخراج DNA
جهت استخراج DNA از کیت DNA سیناژن استفاده شد. استخراج طبق دستورالعمل شرکت سازنده انجام می­گرفت که به اختصار بدین شرح بود:

 

 

    • کشت باکتری ها در محیط مایع که در اینجا از TSB استفاده می­شد و به مدت ۲۴-۱۸ ساعت گرم­خانه­گذاری می­شدند.

 

    • نمونه باکتری ها در میکرو تیوب­های ۲ میلی­لیتری ریخته می­شدند و با سرعت rpm 4000 و به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفیوژ می­شدند.

 

    • مایع رویی دور ریخته می­شد.

 

    • ۱۰۰ میکرولیتر Prelysis Buffer اضافه می­شد.

 

    • ۲۰ میکرولیتر Lysosyme اضافه و در دمای ۳۷ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ دقیقه گرم­خانه­گذاری می­شدند.

 

    • ۱۰ میکرولیتر Ributinase اضافه و در دمای ۵۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ دقیقه گرم­خانه­گذاری می­شدند. .

 

    • ۴۰۰ میکرولیتر Lysis Buffer اضافه و به مدت ۲۰ ثانیه ورتکس می­شدند.

 

    • ۳۰۰ میکرولیتر Precipation Buffer اضافه و به مدت ۵ ثانیه ورتکس می­شدند.

 

    • سوسپانسیون به Spin Columns با تیوپ­های جمع­آوری انتقال داده می­شدند.

 

    • در rpm 13000 برای ۱ دقیقه سانتریفیوژ و تیوپ­های جمع­آوری دور انداخته می­شدند.

 

    • Spin Column ها به تیوپ­های جمع­آوری جدید انتقال داده می­شدند.

 

    • ۴۰۰ میکرولیتر Wash Buffer | اضافه می­شد.

 

برای

دیدگاهتان را بنویسید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *