تحقیق با موضوع داده های ترکیبی، شمال ایران، ارزش گذاری

پایان نامه ها

ریخته شد.
3. میکروتیوب حاوی ژل وزن گردید، در صورتی که وزن ژل بیش از mg 400 باشد، بایستی از دو تیوب ستونی استفاده شود.
4. بافر یک به اندازه 5 برابر وزن ژل اضافه شد.
5. سپس میکروتیوب به مدت 10 دقیقه در بن ماری °C60 قرار داده شد و در فواصل زمانی به آرامی تکان داده شد تا قطعه ژل به صورت کامل حل شود.
6. محتویات میکروتیوب به تیوب ستونی انتقال داده و به مدت 1 دقیقه و با دور rpm 13000 سانتریفوژ شد.
7. مایع زیرین درون میکروتیوب دور ریخته شد و سپس ستون به میکروتیوب استریل دیگر منتقل شد.
8. lµ500 از بافر 2 (WB) به ستون اضافه شد و به مدت 1 دقیقه شانتریفوژ شد.( این مرحله باعث از بین رفتن نمک ها و سایر ناخالصی ها می شود.)
9. تیوب ستونی را مجددا روی میکروتیوب دیگری قرار داده و به مدت 2 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریقوژ شد تا خشک شود.
10. تیوب بر روی میکروتیوب دیگری قرار داده شد و lµ30 از بافر3 (EL) به مرکز آن اضافه شد و به مدت 1 دقیقه بدون حرکت در دمای اتاق قرار داده شد.
11. در انتها ستون به مدت 1 دقیقه با دور rpm 13000 سانتریقوژ شد و مایع زیرین حاوی DNA بدست آمد.

2- 4-6 تعیین توالی قطعات تکثیر یافته و آنالیز آنها:
محصولاتPCR خالص شده جهت تعیین توالی مستقیما به شرکت Macrogen در کشور کره جنوبی فرستاده شد. به منظور تعیین ترادف های نوﻛﻠﺌﻮتیدی، نمونه های مربوط به nrDNA ITS از آغازگر های Forward و Reverse (ITS4 & ITS5) و برای نمونه های مربوط به توالی cpDNA trnL-F از آغازگرهای trnL-Ff و trnL-Fc استفاده شد که با استفاده از شیوه توالی یابی Sanger، توسط دستگاه AB137DXL Sequencer، از هر دو انتهای ´3 و´5 رشته DNA تکثیر شده تعیین توالی شدند. پس از تعیین توالی، توالی ها با استفاده از نرم افزار2.01 Chromas v. مشاهده و به صورت فرمت Fasta ذخیره شدند. هر یک از توالی های Forward و Reverse، با استفاده از نرم افزار Geneious و یا به صورت چشمی و دستی همردیف سازی شدند. بعد از مرحله ی همردیف سازی و ویرایش توالی ها، توالی ها در GenBank ثبت شدند.
به منظور دستیابی به توالی های نوﻛﺌﻮتیدی مربوط به توالی های ITS و trnL-F هر یک از گونه های مورد بررسی سرده Violaceae ، به جستجو در بانک های اطلاعاتی GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov) و EBI (www.srs.ebi.ac.uk) پرداخته شد و با استفاده از BLASTN (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) جستجوهای همولوژی به عمل آمد. توالی نمونه ها به همراه توالی های بدست آمده از بانک ژنی، به کمک برنامه آنلاین ClustalW (www.ebi.ac.uk/clustalw/) و MAFFT (http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html) مقایسه و مطابقت65 داده شدند (Multiple sequence alignment). پس از تطبیق توالی ها به صورت اتوماتیک با استفاده از برنامه ClustalW، توالی ها با فرمت Fasta و در برنامه MAFFT با فرمت clustal ذخیره شده و ویرایش نهایی توالی ها، به صورت دستی و با استفاده از نرم افزار Bioedit ver. 7.0.9 (Hall, 1999) و Mesquite v.2.01 (http://mesquiteproject.org/) صورت گرفت.

2-4-7 آنالیز فیلوژنتیکی
جهت تعیین ارتباط میان سرده های مورد مطالعه و رسم درخت فیلوژنتیکی، ماتریکس داده های همردیف سازی شده ی داده های مولکولی برای هر دو قطعه مورد مطالعه، با روش بیشینه صرفه جویی66 با استفاده از نرم افزار PAUP* 4.b10 (Swofford, 2002) و روش بیشینه احتمال67 با نرم افزار TreeFinder (Gangolf Jobb, 2011) آنالیز شدند. درخت های رسم شده با نرم افزارTree view (Page, 1996) مشاهده شد. قابل ذکر است که دو گونه V. congesta وV. cotelydon به عنوان برون گروه68 در نظر گرفته شدند.

2-4-7-2 روش بیشینه صرفه جویی
پس از انجام آنالیز های فیلوژنی بر اساس روش بیشینه صرفه جویی مناسب ترین درخت، درختی است که برای توزیع داده ها (توالی های نوﻛﻠﺌﻮتیدی) به حداقل تغییرات نیاز داشته باشد و بنابراین بهترین درخت، کمترین تغییرات را در مسیر تکامل متحمل شده و کمترین میزان هموپلازی ناشی از همگرایی یا برگشت را دارد و کوتاه ترین درخت است. در این آنالیز این احتمال می رود که چندین درخت کوتاه بدست آید، در این صورت درخت توافقی69 برای آنها تعریف می شود. در این درخت کلادهای مشترک بین آن درختان نشان داده می شود ولی روابط ناسازگار بین آنها به صورت پلی تومی دیده می شود(Soltis, 2003) .
تمامی سری داده ها با استفاده از روش بیشینه صرفه جویی(MP) تعبیه شده در نرم افزار PAUP* مورد آنالیز قرار گرفت. برای آنالیز داده های nrDNA ITS، cpDNA trnL-F و ترکیب این دو از جستجوی ابتکاری70 توسط نرم افزار PAUP* استفاده گردید. برای تعیین حدود اطمینان کلادها در درخت توافقی حاصل از هر یک از آنالیزهای مذکور آنالیز Bootstrap (felsenstein, 1985) با روش جستجوی ابتکاری انجام شد. تعداد تکرارها در تمام آنالیزهای ارزش گذاری، 1000 تکرار در نظر گرفته شد.

2- 4- 7-3 روش بیشینه احتمال71
روش بیشینه احتمال (ML) اساساً در جهت بنای فیلوژنی مولکولی است. شخصی به نام Felsenstein (1981)، این روش را به عنوان چارچوبی در جهت استنباط فیلوژنتیکی نوﻛﻠﺌﻮتیدها قرار داد. بعد از آن همچنین این روش برای توالی های آمینواسیدی نیز به کار گرفته شد(Kishino et al., 1990) .
بیشتر مطالعات کامپیوتری نشان داده اند که برنامه های ML نسبت به سایر روش ها می توانند برای سری داده های بدست آمده صحیح ترین درخت را تحت پوشش خود قرار دهد (Huelsenbeck & Hillis, 1993; Kuhner & Felsenstein, 1994; Huelsenbeck, 1995; Rosenberg & Kumar, 2001; Ranwez & Gascuel, 2002) .
مزیت مهم دیگر این روش توانایی آن در مقایسه درختان مختلف و مدل های تکاملی آنها با استفاده از یک چارچوب آماری می باشد. اگر چه، مشابه تمام معیار های بهینه سازی بر مبنای مدل فیلوژنتیکی، ML به علت مشکلات محاسباتی از کار بازداشته می شود، زیرا این ﻣﺴﺌﻠﻪ آن
ر
ا در بدست آوردن درختی بهینه با قطعیت بالا حتی از سری داده های مناسب غیر ممکن می سازد (Swofford et al., 1996). علاوه بر این، مشکلات محاسباتی با روش ML بسیار زیاد است، زیرا درخت احتمالی تنها به توپولوژی درخت وابسته نیست بلکه با پارامتر های عددی از جمله طول شاخه نیز مرتبط است.
ولی با این وجود می توان گفت درخت هایی با بیشترین احتمال دقیق تر از سایر درخت ها به نظر می آیند، زیرا این روش، درختی ایجاد می کند که با بیشترین احتمال (بر اساس آمار) انطباق را توصیف می نماید. به عبارت دیگر انطباق یک داستان کوچک است که توضیح می دهد چگونه یک سری از جهش ها در یک توالی اجدادی به تنوع های مشاهده شده منتهی می شوند. روش بیشینه احتمال برای تضمین این واقعیت است که درخت و انطباق دقیقاً یک داستان را بگویند. ایجاد درخت با این روش محدود به مجموعه داده های کوچک می شود، زیرا زمان خیلی زیادی برای محاسبه نیاز دارد.
تمام سری داده ها با استفاده از روش بیشینه احتمال با استفاده از نرم افزار PAUP* مورد آنالیز فیلوژنی قرار گرفتند. برای آنالیز داده های nrDNA ITS، cpDNA trnL-F و ترکیب این دو مدل، مدل های تکاملی با استفاده از برنامه MrModeltest 3.7 (Posada, 2004) بر اساس معیار اطلاعاتیAIC 72 و 73hLRT (وابسته به تعداد تاکسون های مورد بررسی) انتخاب شدند. بر طبق این آنالیز مجموعه داده ها با استفاده از مدل های TrN+I+G و K81uf+I+G ، به ترتیب برای داده های nrDNA ITS و cpDNA trnL-F آنالیز شدند. مجموعه داده های ترکیبی با مدل TrN+I+G آنالیز شدند. بعد از بدست آوردن داده های نهایی همان طور که عنوان شد از برنامه PAUP* 4.b10 (Swofford, 2002) برای آنالیزهای فیلوژنتیکی با بیشینه احتمال استفاده می شود.

2- 4-7- 5 مقایسه دو روش آنالیزی MP و ML:
در روش بیشینه صرفه جویی بهترین تفسیر از درخت ساده ترین تفسیر است. در این روش درختانی انتخاب می شوند که حداقل تعداد تغییرات را داشته باشند. مزایای این روش این است که انتخاب درخت با کوتاه ترین طول، تعداد جانشینی های نوﻛﻠﺌﻮتیدی و هموپلازی ناشی از تکامل مـوازی و برگشت را نیز به حداقل می رساند. این روش آنالـیزی به آسانی در برنامه PAUP* و TNT قابل اجرا است و می تواند جایگاه های اطلاعاتی و مشکل دار را شناسایی کند. همچنین این روش قادر است به حالت های اجدادی نیز پی ببرد. از معایب این روش این است که ممکن است بر اساس توالی های وارد شده، نتایج متفاوتی ناشی از چندین جستجو بدست آید. همچنین این آنالیز با مجموعه داده های بزرگ نسبتاً کند انجام می شود

2- 4-7- 6 نحوه ی ترکیب دو مجموعه اطلاعاتی trnL-F و ITS:
به منظور ترکیب داده های دو مجموعه nrDNA ITS و cpDNA trnL-F، تنها کافی است در فایل اصلی (.fasta) یکی از داده ها، به طور مثال فایل بدست آمده از داده های nrDNA ITS، داده های هر یک از نمونه های مرتبط به cpDNA trnL-F را به انتهای همان نمونه افزوده و تعداد تاکسون ها و کارکتر ها را طبق فایل بدست آمده بازسازی شود. فایل بدست آمده را می توان به عنوان یک فایل ورودی جهت استفاده از روش های نام برده شده برای آنالیز فیلوژنی داده ها استفاده کرد.

3-1 کلید شناسایی گونه های Viola در شمال ایران
1- گیاهانی همی کریپتوفیت، گوشوارک ساده تا شرابه دار یا به ندرت دندانه دار، خامه در انتها قلاب مانند………………2
– گیاهانی تروفیت، گوشوارک بزرگ و برگ مانند یا منقسم چند لوبی، خامه در انتها پهن و دارای سر گرد (sect. Melanium)………………………………………..……………………………………………………………………………..11
2- گوشوارک تا یک سوم به دمبرگ چسبیده است، ساقه رونده وجود ندارد (sect. Plagiostigma)…………… V. somchetica
– گوشوارک کاملاً آزاد، اغلب ساقه رونده دار………………………………………..………………………………………………….3
3- برگ ها قاشقی، با قاعده گوه ای، گلهای خود بارور در تابستان دیده نمی شود (sect. Spathulidium)…………….V. spathulata
– برگ ها قلبی، دایره ای تا کلیوی، قاعده قلبی، گلهای خود بارور در تابستان دیده می شود (sect. Viola)……………4
4- گیاه بدون ساقه گل دهنده مشخص (subsect. Viola)……………………..………………………………………………….5
– گیاه دارای ساقه گل دهنده مشخص…………………………………………………………………………………………………………….7
5- گوشوارک نیزه ای پهن-تخم مرغی و غشایی و کمرنگ به طول mm 5/4-3 با شرابه های بلندتر از mm1،، برگ ها قلبی نوک کند تا دایره ای شکل، تعداد دندانه ها در هر طرف پهنک بین 27 – 20 عدد، گل ها بنفش تیره به ندرت سفید با مرکز ارغوانی، براکته ها به طول mm5 ……………….. ………………………………………………………………………………..V. odorata
– گوشوارک نیزه ای باریک تا مثلثی، به عرض mm 5/2-1، برگ ها قلبی تا سه گوش………………………………………6
6- گوشوارک به عرض mm 5/2-2، برگ ها سه گوش- قلبی شکل، حاشیه محدب به طرف رأس، گیاه بدون کرک یا به ندرت با کرک های پراکنده، تعداد دندانه ها 12 تا 15 عدد در هر طرف پهنک، گل ها بنفش با مرکز سفید………………..………………………………………………………………….V. sintenisii
– گوشوارک خطی به عرض mm 5/1-1 با شرابه های بلند، برگ ها قلبی شکل، حاشیه تقریباً مستقیم به طرف رأس، گیاه دارای کرک های بلند (تا mm 1)، تعداد دندانه ها کمتر از 14 عدد در هر طرف پهنک، گل ها کاملاً سفید یا بنفش با مرکز

پاسخی بگذارید

نشانی ایمیل شما منتشر نخواهد شد. بخش‌های موردنیاز علامت‌گذاری شده‌اند *