پایان نامه با موضوع b، استاندارد، تیتر

پایان نامه ها

آمونیوم…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….88
شکل 3-8 دیالیز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………89
شکل 4-1کلونی هموفیلوس آنفلانزا روی محیط شکلات آگار………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………107
شکل 4-2 تست آکروفلاوین…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….107
شکل 4-3 طیف سنجی NMR ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….110
شکل 4-4 منحنی FTIR……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..111
شکل 5-5 آزمون ایمونوژل دیفیوژن…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….116
شکل 4-6- الکتروفورز (SDS-PAGE) برای PRP-ETA و ETA…………………………………………………………………………………………………………………………………..117

فهرست جدول ها و نمودارها
عنوان صفحه
نمودار 3-1نمودار استاندارد لوری…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..83
جدول 4-1 شاخص های فرمانتاسیون Hib جدول…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..108
نمودار 4-1 تغییرات جذب نوری برای رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-2 تغییرات PH در رشد Hib…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….109
نمودار 4-3 تغییرات گلوکز در رشد Hib……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………110
جدول 4-2 تهیه استاندارد برای غلظت ریبوز………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
نمودار 4-4- منحنی استاندارد ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………112
جدول 5-3- میزان ریبوز……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….112
نمودار 5-5- منحنی استاندارد پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 4-4- میزان پروتئین……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………113
جدول 5-4- میزان اسید نوکلئیک………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..114
نمودار 4-6-منحنی OD فرکشن های کونژوگه …………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………115
جدول 4-5- عیـار آنتی بادی…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………….118
جدول 4-6- تیتر آنتی بادی باکتری کشی واکسن کونژوگه (PRP-ETA) و PRP در روزهای 15،30، 45…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………. ..
..
………………………………………………………………………………………………………………………………………119

چکیده
هموفیلوس آنفلوانزا سروتیپ b مهمترین عامل مننژیت و پنومونی در کودکان زیر 5 سال در سراسر جهان می باشد که پس از کلونیزه شدن در حلق وارد خون شده و باکتریمی می دهد،در ادامه باکتری از طریق خون خود را به مننژ رسانده و مننژیت می دهد که عامل 95% باکتریمی و مننژیت ها هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b می باشد که از کپسول پلی ساکاریدی آن موسوم به پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP) جهت تولید واکسن های کونژوگه گلیکوپروتئینی علیه هموفیلوس آنفلوانزا تیپ b استفاده شده است.به دلیل اینکه پاسخ ایمنی نسبت به این پلی ساکارید غیر وابسته به سلول T بوده و در پاسخ ایمنی سلول خاطره ایجاد نمی گردد،لذا دوز یادآور تاثیری در بالا بردن سطح ایمنی ندارد.برای از بین بردن خاصیت T-INDEPENDT،PRP به طور کوالانسی به اگزوتوکسین A سودوموناس آئروژینوزا (ETA) متصل می گردد.در این پروژه سویه استانانداردهموفیلوس آنفلونزا سروتیپ b ابتدا در فرمانتور حاوی محیط CY (کازآمینواسید – عصاره مخمر )کشت گردید و تخلیص PRP از مایع کشت با انجام روش های الکل پرسپیتاسیون (رسوب دادن الکلی) و رسوب دادن با ستاولن (هگزادسیل تری متیل آمونیوم بروماید)،التراساتریفیوژ و تخلیص با هیدروکسی آپاتیت حاصل گردید.جهت تهیه اگزوتوکسین A نیز سویه PA103 سودوموناس آئروژینوزا در محیط کشت تریپتیکازسوی براث کشت گردید و پس از سنجش توکسیسیته در موش با استفاده از روش قلیایی ،سم زدایی شده و جهت کونژوگه نمودن با PRP از ADHو سیانوژن بروماید به عنوان اسپیسر و EDAC به عنوان عامل لینکر استفاده گردید و کونژوگه حاصل با عبور از ستون CL-4B تخلیص شد.
کونژوگه بدست آمده جهت ارزیابی ایمونولوژیکی طی 2 مرحله با فاصله 14 روز به تعدای خرگوش سفید نیوزیلندی تزریق گردید و از هر کدام از خرگوش ها در روزهای 0،15،30،45 خونگیری از قلب انجام شد.تیتر آنتی بادی توسط سرم باکتریسیدال اسی اندازه گیری شد.تیتر باکتری کشی برای PRP خالص در تزریق اول 16 و در تزریق دوم شاهد افزایش تیتر نبودیم.تیتر باکتری کشی برای کونژوگه در تزریق اول 32 و در تزریق دوم 64 بود که شاهد افزایش تیتر بودیم.با توجه به نتایج حاصل شده ،کونژوگه PRP-ETA سبب تحریک بیشتر سیستم ایمنی و افزایش تیتر آنتی بادی در تزریق دوم می گردد.همچنین اگزوتوکسین A دتوکسیفای شده یک کریر مناسب می باشد.
کلید واژه:
هموفیلوس آنفلونزا تیپ b، سودوموناس آئروژینوزا،واکسن کونژوگه، پلی ریبوزیل ریبیتول فسفات (PRP)، اگزوتوکسین A

مقدمه
1-1-1 هموفیلوس آنفولانزا
هموفیلوس آنفولانزا یک باکتری گرم منفی است که اولین بار توسط Pfeiffer در سال 1982 توصیف شد.( پیفر،19822 ) این که هموفیلوس آنفلوآنزا انگل مخصوص